วันพฤหัสบดีที่ 2 มิถุนายน พ.ศ. 2554

รายงานการทำ method validation

แม้ว่ารายงานฉบับนี้จะไม่ได้นำไปใช้เนื่องจากความไม่เป็นเอกภาพ และฐานันดรภาพ ที่มีภายในหน่วยงานหน่วยงานหนึ่ง ที่แต่ละคน ล้วนแต่มีดาวเป็นของตัวเอง แต่รายงานฉบับนี้ ผู้ทำตั้งใจทำอย่างเต็มที่ และใช้เวลาเกือบ 3 เดือนในการทำ method validation การตรวจพิสูจน์เขม่าปืน ด้วย ICP-MS เพื่อขอรับรองระบบ ISO/IEC17025 ตามวิธีปฏิบัติของหน่วยตำรวจลับสากล FBI แม้จะถูกลืมไป แต่เชื่อเหลือเกินว่า จะหาเอกสารแบบนี้อ่านคงไม่ง่าย แทนที่จะเก็บที่ไว้ให้เป็นไฟล์ขยะ จึงขอนำเสนอสู่บล็อก เพื่อเป็นสาธารณะประโยชน์ สำหรับคนที่มองเห็นคุณค่าของมัน  หากมีปัญหาสิ่งใด กรุณาสอบถาม ผู้เขียน


รายงานการทดสอบความถูกต้องของวิธีตรวจพิสูจน์เขม่าปืน
ด้วยเทคนิค ICP-MS จากตัวอย่างที่เก็บโดยวิธีการ Swab

1.0 วัตถุประสงค์ (Purpose)
          เพื่อทดสอบความใช้ได้ของวิธีวิเคราะห์ และขั้นตอนการปฏิบัติงานตรวจพิสูจน์เขม่าปืน ด้วยเทคนิค ICP-MS จากตัวอย่างที่เก็บโดยวิธีการ Swab

2.0 ขอบเขต (Scope)
          เอกสารนี้ครอบคลุมวิธีการทดสอบความใช้ได้ของวิธีวิเคราะห์ และขั้นตอนการปฏิบัติงานการตรวจพิสูจน์เขม่าปืน ด้วยเทคนิค ICP-MS จากตัวอย่างที่เก็บโดยวิธีการ Swab กลุ่มตรวจพิสูจน์เขม่าปืน สำนักนิติวิทยาศาสตร์บริการ

3.0 เอกสารอ้างอิง (References)
          -  Analysis of Gunshot Primer Residue Collection Swab by Inductively Couple Plasma-Mass Spectrometry, J Forensic Science for Testing and Materials, Robert D. Koon, Ph.D
          - Research Chemist, Forensic Science Research Unit, FBI Laboratory, FBI Academy, Quantico, VA

4.0 นิยามและคำย่อ (Terminology and abbreviation)
4.1 QC   Sample หมายถึง ตัวอย่างที่ใช้ตรวจสอบประสิทธิภาพของวิธีวิเคราะห์ โดยใช้สารละลายมาตรฐานที่ทราบค่าความเข้มข้นที่แน่นอนของ Lead, Barium และ Antimony (ในหน่วย µg/mL) แล้วนำมาทำการวิเคราะห์ จำนวน 7 ซ้ำ   และนำมาหาค่าเฉลี่ย เพื่อใช้เป็นตัวแทนค่าที่วิเคราะห์ได้
          4.2 Sample Blank หมายถึง ตัวอย่างสำลีพันก้านพลาสติก: Cotton bud ชุบสารละลายกรดไนตริก 5 % โดยไม่มีการเติมสารอื่นลงไป
          4.3 Accuracy หมายถึง ความถูกต้องของวิธีวิเคราะห์ที่ได้ค่าใกล้เคียงกับค่าที่แท้จริง (true  value)  อาจหาได้จากค่า  % Recovery หรือการตรวจ Certified Reference Material; CRM จำนวน 7 ซ้ำขึ้นไป แล้วนำมาคำนวณหาค่า Relative Error หรือ Relative Accuracy
        4.4 Precision ความแม่นยำ หรือการกระจายตัวของข้อมูล ที่ทำการวิเคราะห์ซ้ำ ๆ กัน หากข้อมูลที่ได้เกราะกุมกันดี จะถือว่ามี Precision ทั้งนี้ การมี Precision ดี ไม่ได้หมายถึงค่า Accuracy ดี 

การหา Precision สามารถทำได้ 2 ลักษณะคือ Repeatability และ Reproducibility ซึ่ง
                       -     Repeatability หมายถึง ความแม่นยำที่เกิดจากการวิเคราะห์ซ้ำ ๆ ในสภาวะเดียวกันโดยวิธีการเดียวกัน ในห้องปฏิบัติการเดียวกัน เครื่องมือชุดเดียวกัน ผู้วิเคราะห์คนเดียวกัน 
                     -       Reproducibility หมายถึง ความแม่นยำที่เกิดจากการวิเคราะห์ซ้ำ ๆ ระหว่างห้องปฏิบัติการ ซึ่งจะมีวิธีการเคราะห์ที่เหมือนกัน แต่ผู้วิเคราะห์ และเครื่องมือที่ใช้วิเคราะห์จะแตกต่างกัน มักทำซ้ำโดยใช้เวลายาวพอสมควร

5.0 Performance Characteristics
5.1  Range และ Linearity
5.2 Accuracy และ Trueness
· การแสดงความใกล้เคียงกันระหว่างค่าเฉลี่ยของผลการทดสอบที่ได้  ( X ) กับค่าอ้างอิง ( µ ) ของตัวอย่างนั้น
· ทั้ง X และ m เป็นค่าเฉลี่ยของกลุ่มข้อมูล  ซึ่งแตกต่างกันที่
m เป็นค่าเฉลี่ยของกลุ่มข้อมูลใหญ่ (ประชากร) เช่น ทดสอบ 50 ซ้ำ
X เป็นค่าเฉลี่ยของกลุ่มข้อมูลเล็ก (ตัวอย่าง) เช่น ทดสอบ 10 ซ้ำ
วิธีการหา Accuracy
                   ทดสอบ CRM ³ 10 ซ้ำ     คำนวณค่าเฉลี่ยได้  =  X1
                   ทดสอบ reagent blank ³ 10 ซ้ำ  คำนวณค่าเฉลี่ยได้  =  X2
                   ค่าเฉลี่ยของ CRM ที่ทดสอบได้  ( X3 )  =  X1 – X2
                   ประเมิน accuracy ได้  วิธี  ได้แก่ 
              1.   ใช้ค่า % recovery
                2.   ใช้ค่า t – test
       ใช้ค่า  % recovery
               % recovery   = (X3) x 100 /  m
       ใช้ค่า  % recovery  ที่ยอมรับได้ ตามเกณฑ์ต่อไป

                  
                   ใช้ค่า  t - test
                     t   = (X3 - m ) / (SD / n1/2 )    ;  df  =  n - 1 
     ประเมินว่าผลการทดสอบไม่แตกต่างจากค่าอ้างอิง
                             ( มี Accuracy) เมื่อ t < tc )
Precision
-   เป็น precision ของผลการทดสอบที่ได้จากการทำซ้ำโดยห้องปฏิบัติการ   หรือผู้ทดสอบหรือเครื่องมือ หรือระยะเวลาที่แตกต่างกัน 
การทำซ้ำในสภาพที่ต่างกัน
     การหา Precision ทำเช่นเดียวกับการหา accuracy นั่นคือ
            ทดสอบ Reagent blank   และ CRM อย่างละไม่น้อยกว่า 10 ซ้ำ
           ทดสอบ Sample blank   และ fortified sample blank อย่างน้อย 3 ความเข้มข้น ๆ ละไม่น้อยกว่า 10 ซ้ำ
                   ประเมิน precision  โดยใช้  HORRAT
                     precision ดี  เมื่อ  HORRAT  <  2
            HORRAT (Horwitz’s ratio)   =   %RSD / predicted RSD
                       %RSD =   (SD / X) x 100
            Predicted RSD:
Repeatability:  PRSD = 0.66 x 2 (1 - 0.5log C)
        Reproducibility: PRSD = 2 (1 - 0.5log C)
C = concentration ratio
             เช่น   10 ppm = 10 x 10-6     =   10-5
                      10% = 10 x 10-2     =   0.1


LOD และ LOQ
Limit of Detection (LOD)
              ความเข้มข้นต่ำสุดที่วิธีวิเคราะห์นั้นๆ สามารถตรวจพบได้
Limit of Quantitation (LOQ)
              ความเข้มข้นต่ำสุดที่วิธีทดสอบนั้นๆ สามารถทดสอบและรายงานผลได้  โดยมี Accuracy และ precision ที่ยอมรับได้




การวิเคราะห์เชิงปริมาณ  สามารถทำได้  3 วิธี ได้แก่
1.  กรณี sample blank มีค่า
              -  ทดสอบ reagent blank ≥ 10 ซ้ำ คำนวณค่าความเข้มข้นเฉลี่ย (X1)
              -  ทดสอบ sample blank ≥ 10 ซ้ำ คำนวณค่าความเข้มข้นเฉลี่ย (X2)
              -  LOD   =   (X2 – X1) + 3 SD
2.  กรณี sample blank ไม่มีค่า
        -  ทดสอบ fortified sample blank ที่ความเข้มข้นน้อยๆ 10 ซ้ำ
        -  LOD   =    3 SD



3.  ใช้ fortified sample blank 3 ความเข้มข้น
              -  ทดสอบ fortified sample blank ที่ระดับความเข้มข้นภายใน range 3 ความเข้มข้น ๆ ละ 10 ซ้ำ 
              คำนวณ SD ของแต่ละความเข้มข้น
              เขียนกราฟระหว่างความเข้มข้น (แกน X) กับ SD (แกน Y)
              -  จุดตัดแกน Y คือค่า SD
              -  LOD   =   3 SD

สำหรับการวิเคราะห์เชิงคุณภาพ  สามารถทำได้ดังนี้
              -  ทดสอบ fortified sample blank ที่ระดับความเข้มข้นต่างๆ ระดับละ 10 ซ้ำ 
              ตรวจสอบผล positive และผล negative
              -  LOD   =   ความเข้มข้นต่ำสุดที่ให้ผล positive ทั้ง 10 ซ้ำ

                           ความเข้มข้น                                      ผลทดสอบ
     (ppm)                                     positive : negative
200                                            10:  0
100                                             10:  0
75                                                5:  5
 50                                                1:  9

Predicted LOQ สามารถทำได้ 2 วิธี ได้แก่

1.  กรณี sample blank มีค่า
              -  ทดสอบ reagent blank ≥ 10 ซ้ำ คำนวณค่าความเข้มข้นเฉลี่ย (X1)
              -  ทดสอบ sample blank ≥ 10 ซ้ำ คำนวณค่าความเข้มข้นเฉลี่ย (X2)
              -  Predicted LOQ   =   (X2 – X1) + 10 SD
2.  กรณี sample blank ไม่มีค่า
        -  ทดสอบ fortified sample blank ที่ความเข้มข้นน้อยๆ 10 ซ้ำ
        -  Predicted LOQ   =    10 SD
         -  ทดสอบ sample blank ≥ 10 ซ้ำ
       -  ทดสอบ fortified sample blank ที่มีความเข้มข้นเท่ากับ Predicted LOQ ≥ 10 ซ้ำ
       ตรวจสอบ outlier, accuracy และ precision ของ fortified sample blank
         
Robustness / Ruggedness
  -  ทดสอบตัวอย่าง (CRM) โดยเปลี่ยนแปลงปัจจัยครั้งละ 1 ปัจจัย เช่น เปลี่ยนระยะเวลาที่ใช้ในการทำปฏิกิริยา  
 -  ประเมินจาก accuracy และ precision     
6.0 เครื่องมือ (Equipment and supplies)
          5.1 เครื่องตรวจวัดมวลไอออนของธาตุที่เป็น Metal ที่มีตัวจับสัญญาณสเปกตรัมชนิด Electron multiplier Detector (EMD) Inductively Couple Plasma Mass-Spectrometer (ICP-MS)  Agilent รุ่น 7500 CE  บริษัท Agilent Limited, Thailand
          5.2 อ่างน้ำควบคุมอุณหภูมิ (Water Bath) โดยกำหนดอุณหภูมิในการทดสอบที่ 80 องศาเซลเซียส
          5.3 Auto-Pipette ขนาด 20-200 µL และ 1-5 mL ที่มีใบรับรองคุณภาพ Quality Control Certificate ยี่ห้อ Favorite serial number DT80160 และ DR52134 ตามลำดับ

7.0 สารเคมีที่ใช้ในการทดสอบ (Materials)
1. สารละลายมาตรฐาน ที่สามารถทวนสอบได้ถึงมาตรฐาน NIST ;( National Institute of Standard and Technology; NIST) และได้รับใบประกาศคุณภาพความถูกต้อง ในการรับรองคุณภาพมาตรฐาน ISO/IEC 17025 และ 9001-2000 จำนวน 5 รายการ ดังนี้
·       สารละลายมาตรฐานแอนติโมนี่; Sb 1,000 µg/mL    ใน 2-5 % (v/v) nitric  acid   
·       สารละลายมาตรฐานแบเรียม; Ba 1,000 µg/mL  ใน 2- 5 % (v/v)  nitric acid      
·       สารละลายมาตรฐานตะกั่ว; Pb 1,000 µg/mL  ใน 2 - 5 % (v/v)  nitric  acid       
·       สารละลายมาตรฐานอินเดี่ยม; In 1,000 µg/mL  ใน 2-5 % (v/v)  nitric  acid
·       สารละลายมาตรฐานบิสมัส; Bi 1,000 µg/mL  ใน 2-5 % (v/v) nitric  acid 
 2. High purity nitric acid ยี่ห้อ Merge
 3. น้ำกลั่นบริสุทธิ์ ชนิด RO; Reverse Osmosis water 18 Mega ohm
                    4. สารละลาย Tune Solution 1 µg/L สำหรับใช้ตรวจสอบ Performance ของเครื่อง ICP-MS

8.0 วิธีทดสอบความถูกต้องของวิธีวิเคราะห์ (Experimentation)
8.1   การเตรียม Spiking Sample
เตรียม Stock Standard solution ที่ประกอบด้วย [Sb] 10 µg/mL  , [Pb] 50 µg/mL  และ [Ba] 50 µg/mL ทำการ Spike สารละลายมาตรฐาน ที่มีความเข้มข้นต่างกัน 3 ความเข้มข้น  โดยสารละลายมาตรฐาน Pb กำหนดช่วงความเข้นข้น 200-400 µg/L , Ba กำหนดช่วงความเข้นข้น 100-300 µg/L และ Sb กำหนดช่วงความเข้นข้น 10-40 µg/L  การทดสอบวิธีวิเคราะห์ครั้งนี้  แบ่งทำเป็น 2 ชุด
ชุดที่ 1 Spike สารละลายมาตรฐานลงบนสำลีพันปลายก้านพลาสติก .ในหลอด PE ขนาด 15 mL
ชุดที่ 2 Spike สารละลายมาตรฐานลงในหลอด PE เปล่าๆ  
หลัง Spike ทำการเติมสารละลายกรดไนตริก 5 % ลงไป จนได้ปริมาตรประมาณ 0.2 mL นำตัวอย่างเข้าอบใน Oven ตั้งอุณหภูมิที่ 80 องศาเซลเซียส นาน 1 คืน โดยไม่ต้องปิดฝา
สามารถสรุปความเข้มข้นของสารละลายมาตรฐานที่ใช้ทำการวิเคราะห์ ได้ ดังตารางที่ 1
Type
stock
nitric
stock
nitric
stock
nitric
stock
nitric
stock
nitric
volume
0.08
0.12
0.06
0.14
0.04
0.16
0.02
0.18
0.01
0.19
Pb
400 ppb
300 ppb
200 ppb
(100 ppb)
(50 ppb)
Ba
(400 ppb)
300 ppb
200 ppb
100 ppb
(50 ppb)
Sb
(80 ppb)
(60 ppb)
40 ppb
20 ppb
10 ppb

           * ตัวเลขที่มีแถบสี เป็นความเข้มข้น 3 ค่า สูง กลาง ต่ำ ของธาตุที่ต้องการวิเคราะห์ 
           ** ตัวเลขในวงเล็บ เป็นความเข้มข้นของธาตุที่ไม่สนใจ แต่มีอยู่ในตัวอย่าง
8.2 การสกัดแยก (Extract Procedure)
              8.2.2 เติมสารละลายกรดไนตริก 10 % ลงไป หลอดละ 10 mL
              8.2.3 Mix ด้วย Vortex mixer แล้วอุ่นใน Water Bath ที่ 80 องศาเซลเซียส 2 ชั่วโมง
แล้วจึงนำไปเข้าเครื่อง Centrifuge นาน 5 นาที เพื่อช่วยแยกสำลีออกจากสารละลาย สารละลายที่สกัดได้นี้ นำไปใช้ทำการวิเคราะห์หาธาตุสำคัญที่เกิดจากการยิงปืน (GSR) โดยค่า Dilution Factor = 1: 10
               8.2.4 การเตรียม internal standard solution ที่มี In และ Bi vอย่างละ 50 µL
                   เตรียมโดยใช้ Volume metric flask ขนาด 10 mL เติมกรดไนตริก 5 % ลงไปประมาณครึ่งหนึ่ง แล้วใช้ Auto-pipette ดูด stock solution ที่มี In และ Bi อยู่อย่างละ 10 µg/mL จำนวน 50 µL แล้วเติมกรดไนตริก 5 % ปรับปริมาตรให้ได้ 10 mL ดังตาราง   
Standard
Conc. µg/mL
In
Bi
Hno3
total.V
Conc.final
single std
1000
0.1
0.1
~9.99
10
10 µg/mL
stock std
10
0.05
0.05
~9.9
10
50 µg/L
8.3 การสร้าง External Standard Calibration Curve
เตรียมโดยใช้ Single standard solution เตรียมเป็น Stock standard solution ที่ประกอบด้วย Pb และ Ba  50 µg/mL  และ Sb 10 µg/mL  จากนั้นนำ Stock standard มาเตรียม working standard solution โดยใช้กรดไนตริก 5 % เป็นตัวทำละลาย โดยเตรียมทั้งสิ้น 6 ความเข้มข้น ดังแสดงในตารางที่ 2

Level
Concentration
 : ppb
volume : mL
Pb
Ba
Sb
HNO3 acid
Stock
1
1000
1000
200
9.8
0.2
2
750
750
150
9.85
0.15
3
500
500
100
9.9
0.1
4
250
250
50
9.95
0.05
5
100
100
20
9.98
0.02
6
50
50
10
9.99
0.01

8.4 ตรวจสอบ Performance และ Stabilities ของเครื่อง ICP-MS; โดยทำมากกว่า 2 ครั้ง การทดสอบครั้งนี้ทำใน Mode Spectrum และการปรับค่า parameter ทำตามคู่มือปฏิบัติการใช้เครื่อง ICP- MS (SD006/49) ค่าของ Intensity ในหน่วย Count per Second; CPS ต้องอยู่ภายใต้เงื่อนไขดังนี้            
Sensitivity ของ     7Li     ≥ 2,000
                        89Y    6,000
                        205Tl   ≥ 3,000
Oxide < 1.5
Double Charge < 3.0
หลังจากได้ค่าของ Intensity ตามเงื่อนไขแล้วจึง ปรับค่า PA-Factor ของธาตุที่จะทำการวิเคราะห์ ดังแสดง
9.  ผลการทดสอบ performance characteristics ของวิธีวิเคราะห์ ดังนี้
·       Range และ Linearity
·       Accuracy
·       Precision
·       Limit of Detection (LOD)
·       Limit of Quantification (LOQ)

ผลการวิเคราะห์ Quantitative blank จากการตรวจสารละลายกรดไนตริก 5 % ซึ่งจะต้องนำไปลบออกจากค่าที่ได้จากการวิเคราะห์ โดยเทียบค่าความเข้มข้นกับ External Standard Calibration curve
ซึ่งแสดงให้เห็นว่า Detection Limit ของเครื่อง ICP-MS ขณะทำการทดสอบวิเคราะห์ครั้งนี้ จะมีช่วงความเข้มข้นต่ำสุดที่เครื่องจะวิเคราะห์ได้ (DL) เป็นดังนี้
 Pb มีปริมาณเท่ากับ 3.370 ppb
 Ba มีปริมาณเท่ากับ 34.69 ppb
 Sb มีปริมาณเท่ากับ 15.81 ppb
ความเป็นเส้นตรงและพิสัย (Linearity and Range)
 ความเป็น Linearity ที่ได้จากการวิเคราะห์ตัวอย่าง โดยใช้สารละลายมาตรฐานช่วงความเข้มข้นที่กำหนด เมื่อทำการสร้าง Calibration ทั้งแบบ Internal Standard Addition และ แบบ External Standard Calibration มีค่า R2 ที่มากกว่า 0.995   จึงถือว่าวิธีวิเคราะห์มีความเป็นเส้นตรงอยู่ในช่วงความเข้มข้น ดังนี้ คือ Sb ที่ช่วงความเข้มข้น 10 - 200 ppb
Ba ที่ช่วงความเข้มข้น 50 – 1000 ppb
Pb ที่ช่วงความเข้มข้น 50 – 1000 ppb
และสามารถใช้ Internal Standard In และ Bi 50 ppb ในการแก้ไขเรื่อง Interfere จาก Matrix effect ได้
ดัง Calibration curve ที่แสดง ต่อไปนี้
Calibration curve ของ อัตราส่วนของ Sb กับ In ช่วง 10 200 มีค่า r = 0.9999
Calibration curve ของ อัตราส่วนของ Ba กับ In ช่วง 50 1000 ppb มีค่า r = 1.0 
Calibration curve ของ อัตราส่วนของ Pb กับ Bi ช่วง 50 1000 ppb มีค่า r = 1.0
ผลการทดสอบความใช้ได้ของวิธีวิเคราะห์
ตารางแสดงผลการวิเคราะห์ธาตุ Pb, Ba และ Sb เมื่อทำการวิเคราะห์ตัวอย่าง Spike เป็นดังนี้
                              
   ผลที่วิเคราะห์ได้ในตัวอย่าง: ppb เทียบกับความเข้มข้นที่ Spike

Lead
Barium
Antimony
Spike
400.00
300.00
200.00
300.00
200.00
100.00
40.00
20.00
10.00
ครั้งที่ 1
363.20
289.60
199.45
311.00
185.95
132.20
37.76
17.97
8.89
ครั้งที่ 2
360.40
292.00
176.65
300.20
188.35
196.13
35.27
18.30
9.83
ครั้งที่ 3
384.90
292.00
186.60
310.14
199.65
108.75
35.75
18.90
9.81
ครั้งที่ 4
367.20
276.20
180.40
305.54
197.10
114.45
35.50
16.84
9.09
ครั้งที่ 5
368.93
287.45
185.78
274.25
197.65
191.10
38.60
16.40
9.51
ครั้งที่ 6
376.67
292.70
196.70
283.60
178.60
105.80
37.07
17.22
8.97
ครั้งที่ 7
370.22
288.33
187.60
287.07
176.81
116.57
37.66
18.42
9.30
Average
364.40
288.90
187.60
293.47
189.69
133.13
37.20
18.01
9.43
SD
8.30
5.29
7.55
13.34
8.62
36.17
1.21
0.86
0.36
%Recovery
82.33
84.61
76.26
80.24
85.40
80.38
89.25
82.53
79.25

เมื่อนำค่าที่ได้จากการวิเคราะห์ ทั้งมาหาค่าเฉลี่ย , SD, % RSD เพื่อหา % Recovery ตามสูตร
% Recovery = (ค่าของตัวอย่างที่เติมสารมาตรฐาน ค่าจากตัวอย่างที่ไม่เติม)x 100
                               (ค่าความเข้มข้นของสารมาตรฐานที่เติม)

เกณฑ์การยอมรับสำหรับโลหะหนักในน้ำเท่ากับ 85- 115 ดังนั้น % Recovery ค่าที่ดีที่สุด คือ
                   Pb ความเข้มข้นที่ 300 ppb เท่ากับ 84.61 %
                   Ba ความเข้มข้นที่ 200 ppb เท่ากับ 85.24 %
                   Sb ความเข้มข้นที่ 40 ppb เท่ากับ 89.25   %

ผลการวิเคราะห์ Sample blank
ทำการวิเคราะห์ตัวอย่าง Sample blank จำนวน 10 :ซ้ำ
 สรุปผลการทดสอบวิธีวิเคราะห์
1.      Accuracy และ Precision
2.      Range และ Linearity
3.      LOD และ LOQ